サンドイッチELISAと競合ELISAによる定量

サンドイッチELISAと競合ELISAによる定量

ELISA法とは

酵素結合免疫吸着検査法(以下、ELISA)は、抗体の特異性と、シンプルな酵素測定法の感受性を組み合わせた技術です。測定は容易で、ターンオーバー数が多い酵素を結合した抗体または抗原を用いることによって、抗原または抗体の濃度を測定することができます。

一般的に用いられているELISAのフォーマットには、サンドイッチELISAと競合ELISAの2種類があります(図1)。以下、その2つのELISAについて解説します。

図1 サンドイッチELISAと競合ELISAの差異

サンドイッチELISA

2つの抗体を使って行われるサンドイッチELISAは、未知のサンプル中における抗原濃度の測定に用いられ、最も有用なイムノアッセイ技術の1つとなっています。精製された抗原の標準物質が利用可能な場合、このアッセイによって用量反応曲線を作成し、未知のサンプル中における抗原の絶対量を、迅速かつ正確に判定することができます。

このアッセイでは、以下の手順によって「サンドイッチ」を作製します。

  1. 精製された、標的に特異的な抗体(「捕捉」抗体)を固相に結合。通常は、プレートのウェルの底に接着します。
  2. サンプル(未知量の抗原を含有する可能性があるもの)を加え、結合した抗体と複合体を形成。結合しなかった生成物は、洗浄して除去します。
  3. 標識した2つ目の抗体(「検出」抗体)を加え、抗原に結合。

検出には発色基質が用いられ、マトリックスに結合した2つ目の抗体(標識済み)の量を測定して定量化します。

この技術の主な利点は、使用前に抗原を精製する必要がなく、非常に特異的であるということ。一方、すべての抗体がこのアプリケーションに使用可能なわけではないという欠点もあります。使用する抗体は「マッチドペア」、すなわち、抗原の別々のエピトープを認識し、互いの結合を邪魔しない2種類の抗体の組み合わせである必要があります。これには、別々の部位を認識する2種類のモノクローナル抗体、またはアフィニティー精製済みの単一バッチのポリクローナル抗体のいずれかが用いられます。

固相に結合する捕捉抗体の量は、抗体溶液を希釈したり濃縮したりすることによって容易に調節可能です。抗原に対する抗体の結合活性は、別の抗体と置換することでしか変えられません。2つ目の抗体の比活性は、その抗体の標識部位の数や種類によります。

サンドイッチELISAの感度は、以下の4つの要因に依存します。

  • 固相に結合した1つ目の抗体の分子数
  • 抗原に対する1つ目の抗体の結合活性
  • 抗原に対する2つ目の抗体の結合活性
  • 2つ目の抗体の比活性

競合ELISAアッセイ

特定の標的に対して利用可能な2種類の抗体の「マッチドペア」がない場合、競合ELISAが選択肢となります。競合ELISAアッセイはその名称が示唆する通り、試薬間の競合を利用して抗原の相対量を測定します。このアッセイでは、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの検出用の酵素を、免疫原か一次抗体のいずれかに結合(標識)させます。競合ELISAにはいくつかの様式がありますが、以下に一例を示します。

競合ELISAは次のような手順で行われます。

  1. 非標識の精製した一次抗体を用い、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルをコーティングします。
  2. この一次抗体を、非標識の標準物質および未知のサンプルとインキュベーションし、平衡状態に達するまで反応させます。
  3. 標識した免疫原を加えます。この標識体は一次抗体に結合しますが、②で加えた非標識の免疫原によって既に占有されている結合部位には結合できません。このため、サンプルまたは標準物質中の免疫原の量が多いほど、結合する標識免疫原の量は少なくなります。

平衡状態に達するまで競合させ、プレートに基質を添加します。そして、これによって生じる化学発光または色の変化を測定し、サンプル中に存在する抗原の量を判定します。

競合ELISAの利点は、未精製の一次抗体が使用できることです。前述の通り、複数の様式がありますが、競合する標識免疫原を用いる方法が一般的です。競合ELISAのその他の様式については、以下を参照してください。

A Laboratory Manual, by Ed Harlow and David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York, 1988)

ELISAの基質

沈降する基質を用いるウェスタンブロットとは異なり、ELISAでは水溶性の生成物を産生する基質を用います。よく用いられる酵素は、アルカリホスファターゼ(以下、AP)や、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(以下、HRP)です。酵素基質としては、安定していて、安全、安価なものが理想的です。

これらの酵素は、無色の基質を有色の生成物に変換することができます。例として、p-ニトロフェニルリン酸(以下、pNPP)は、アルカリホスファターゼによって黄色いp-ニトロフェノールに変換されます。ペルオキシダーゼと共に用いられる基質には、2,2’-アゾ-ビス (3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸。以下、ABTS)、O-フェニレンジアミン(以下、OPD)や、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(以下、TMB)などがあり、それぞれ緑色、オレンジ色、青色を呈します。

最も感度の高いELISA検出法では、光を発する化学発光基質の反応を触媒する酵素を用います。例えば、LuminataTM ELISA HRP基質は、HRPによって触媒されると、ルミノメーターを用いて検出可能なシグナルを産生します。

Luminata ELISA HRP基質には次の2種類があります。

シグナルの定量化

シグナルの定量化には、適切な波長で測定するよう設定したプレートリーダーかルミノメーターを用います。サンプルの特異的なシグナルを標準曲線と比較することで、サンプル中の抗原の相対量を推定することができます。

標準曲線の作成には、既知濃度の抗原をX軸に、対応する吸光度をY軸にプロットします。標準曲線は、抗原濃度と対応する吸光度の直接的な関連性を示すグラフになります。すなわち、サンドイッチELISAではサンプル中の抗原濃度が高いほど、吸光度も高くなります。

未知のサンプル中の抗原濃度を判定する際には、サンプルの吸光度をY軸にプロットし、そこから標準曲線と交差するまで平行線を引きます。この点からX軸と交差するところまで縦線を引くと、未知のサンプル中の抗原濃度となります。別の方法としては、データを、MILLIPLEX® Analyst 5.1ソフトウェアなどのコンピュータープログラムによる曲線適合ソフトウェアに入力することもできます。線形回帰分析によって良好な適合が得られますが、試験範囲の上端または末端のデータポイントを除いた方が、良好な適合が得られる場合もあります。

例として、あるELISAの結果を図2に示します。既知濃度の抗原を用い、405 nmで吸光度を測定し標準曲線を作成しました(青線)。サンプルの平均吸光度は1.42 nmでした。標準曲線から推定すると、サンプルは約10 ng/mLの抗原を含有していることになります(赤点線)。

図2 ELISA標準曲線とサンプル解析

以上、サンドイッチELISAと競合ELISAについて解説しました。このアッセイは安全かつ簡便、安価に、特定のタンパク質を検出・定量できるため、広く用いられている重要な技術です。各手法の特徴を理解して、研究に活用しましょう。