RT-qPCRのためのqPCRの基礎とコツ

RT-qPCRのためのqPCRの基礎とコツ

定量PCRとは

定量PCR(quantitative PCR)は、qPCRやリアルタイムPCRとも言われ、決められたサイクル数までの一連のPCRにより発生した蛍光物質を測定する手法です。これによって、qPCR検査でのDNA合成を計測し、蛍光強度から鋳型DNA(主にcDNA)の量を知ることができます。

qPCRは、サンプルにおける目的遺伝子の発現または変異やSNPなどの特定のDNA配列のコピー数を正確に定量化する目的で行われます。遺伝子発現の評価はqPCRの一般的な用途の一つで、目的とするmRNAのコピー数を測定します。少量のmRNAから遺伝子発現を検出し定量化するためには、定量的逆転写PCR(以下、RT-qPCR)による増幅が欠かせません。

この記事では、RT-qPCRについて理解するための基礎知識として、qPCRの概略と、qPCRを成功させるためのコツについて解説します。

qPCRの検出法

qPCRには、サイバーグリーン(SYBR®︎ Green)による検出(インターカレーター法)と、加水分解プローブ法による検出の2種類があります。サイバーグリーンによる検出では、2本鎖DNAに結合してPCR産物を検出する、サイバーグリーンIを使用します。この手法では、非特異的反応産物を含め、増幅されたあらゆる2本鎖DNAを検出します。加水分解プローブ法では、特定のDNA配列を検出できるプローブを用い、特定のDNAの増幅のみを検出します。

加水分解プローブ法よりもサイバーグリーンによる検出のほうが、価格が手頃であり、様々な目的遺伝子の増幅をモニターできるため、サイバーグリーンが用いられることのほうが多いかもしれません。1つの2本鎖DNAに対して複数分子のサイバーグリーンが結合することで、検出感度はより高くなる仕組みです。ただし、サイバーグリーンによる検出は、色素そのものが阻害物質として働く場合や、非特異的DNA配列にも結合し偽陽性を生じる可能性があるという短所があるので、注意して使いましょう。

図1.サイバーグリーンによる検出

加水分解プローブを用いたqPCRは、特異性が重要な場合に選ばれる手法です。蛍光を生じるためにはプローブと標的のアニーリングが必要で、これにより背景ノイズや偽陽性を有意に減らすことができます。また、識別可能な異なる色の蛍光色素を使用することができるため、単一の反応チューブで、異なる2つの配列を検出することができます。加水分解プローブ法の短所としては、コストが高いこと、標的配列ごとに異なるプローブが必要であることなどが挙げられます。

図2. 加水分解プローブによる検出

qPCRにおける遺伝子発現の分析

遺伝子発現の分析には、図1のようなグラフが用いられます。これは典型的なqPCR曲線で、サイクル数に対する蛍光強度をグラフ表示しています。Ct値すなわちサイクルの閾値が緑色の線で示されており、曲線がベースラインから統計学的に有意な値まで明確に上昇している点を示しています。試薬の感度が高いとCt値が低下する場合があり、これは特に標的の発現レベルが非常に低い遺伝子を検査している場合に、有益であることがあります。

図3:qPCR増幅曲線の閾値レベルとCt

qPCR成功のコツ

qPCRを成功させるいくつかの秘訣があります。まず、毎回、標準曲線を用いてプライマーを検証することが望ましいでしょう。理由は主に2つあります。ひとつは、この検証によってプライマーが効率よく、正確に標的を検出できているか確認するためです。これは良質なqPCR実験を行うために非常に重要な要素です。もうひとつは、この検証により検出限界を知ることができ、次の実験に用いるDNAの適量を決定する際に役立つからです。例えば、1 ngのみを使用すればよく、貴重なサンプルを今後の研究のために節約できる場合、わざわざ反応ごとに10 ngを用いる必要はありません。

また、ピペッティングの正確性を向上するため、サンプル(テンプレート)を逐次希釈しサンプルの液量を増やした状態で試験を行うことが望ましいです。

さらに、ネガティブコントロールの1つとしてテンプレートの代わりに水のみを用いるのも重要です。これは試験サンプルとバックグラウンドの増幅レベルを区別するのに有用なだけでなく、反応液内の混入物の検出にも役立ちます。

最後に、使用するDNAが高品質であること、すなわち適切な濃度で、260/280比が良好であり、損傷のないDNAであることを確かめるのも、非常に有用です。

MIQEガイドライン

qPCR実験への最善のアプローチ法を考える場合、もう1つ考慮したいのはMIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiment)ガイドラインです。このガイドラインは、信頼に足るqPCRを行うという難題に取り組むため、2009年に国際調査チームにより発表されました。

MIQEガイドラインでは、qPCRベースの実験の再現性と品質評価のために欠かせない最低限の情報が要求されています。MIQEガイドラインで求められる情報は、以下の8つに分類されます。

  • 実験デザイン
  • サンプルの性質
  • 核酸抽出および品質評価
  • 逆転写
  • 標的の情報
  • プライマーおよびプローブの詳細
  • qPCRプロトコールの最適化と有効化の詳細
  • データ分析

以上、qPCRの概略と、qPCRを成功させるためのコツについて解説しました。qPCRは、遺伝子発現の解析の他にも、様々な用途に用いられている技術です。コツやガイドラインを参考に、より良い実験データを得られるよう工夫してみましょう。