PCR・RT-PCR用酵素の選び方

PCR・RT-PCR用酵素の選び方

酵素の選択がPCRの結果を左右する

より高効率で高精度のPCRを実現するため、また多様な用途に対応するため、これまでにいくつものPCR酵素やRT-PCR酵素が精製、修飾され、商品化されてきました。これらの酵素はそれぞれ特徴があり、その選択はPCRの結果を大きく左右するため、用途や条件に合わせて使い分ける必要があります。この記事では、主な市販の酵素とその選び方について概説します。

Taq DNA Polymerase

PCRに使用するDNAポリメラーゼに求められるもっとも重要な要素は、75℃前後において最適な活性を示すことと、さらに高い温度(95℃)での長いインキュベーション後に活性を維持する能力です。このような理由から、Taq DNA Polymeraseは、耐熱性DNAポリメラーゼとして初めて利用され、幅広く使われてきました。細かな最適化を必要としない一般的なPCRでは、今でもTaq DNA Polymeraseがよく使用されます。より良い結果を得るために、高品質のリコンビナントTaq DNA Polymerase(ロシュ社)の利用がおすすめです。

一方で、標準的なTaq DNAPolymeraseの主な欠点は、最適温度である72℃より低い温度条件でも活性を持つことです。最適化されていないシステムでは、最初のDNA熱変性ステップが始まる前にプライマー同士がアニールし伸長することで、プライマーダイマーを形成してしまう可能性があります。

FastStart Taq DNA Polymerase

Taq酵素の修飾版が開発され、PCRへの有用性が高まっています。これらはTaq DNA Polymeraseのいわゆる「ホットスタート」調製品(FastStart Taq DNA Polymeraseなど)で、低温条件下では活性を示さず、DNA変性温度において活性化されます。したがって、ホットスタートDNAポリメラーゼは、反応セットアップ中に起こるプライマーダイマーの形成を最小限に抑えることができます。

このFastStart Taq DNA Polymeraseですが、耐熱性リコンビナントTaq DNA Polymeraseを化学修飾した酵素で、75℃までの温度条件下では活性を示さないことが特徴です。この酵素はプライマーが非特異的に結合する可能性のない高温条件でのみ活性化されます。この酵素は、実際のサイクルが始まる前のプレインキュベーションのステップ(95℃、2~4分間)で、活性をブロックする官能基がはずれることにより完全に活性化されます。また、他のホットスタートの技術では通常、追加の操作ステップにより酵素を活性化させる必要がありますが、この酵素にはその必要がありません。

したがって、FastStart Taq DNA Polymeraseは、基本的なPCR(最大3kbまでの長さの通常またはGCリッチなテンプレートの増幅を目的とする)では最も優れた酵素と言えます。

プルーフリーディングDNAポリメラーゼ

標準的なTaq DNA Polymeraseや、それを化学的に修飾したFastStart Taq DNA Polymeraseは、増幅反応中に誤ったヌクレオチドが取り込まれるという現象を検出して修復する能力が欠けています。そのために誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除くことができません。したがって、これらのDNAポリメラーゼは、PCRのエラー率が比較的高くなります。さらに、増幅中に誤って取り込まれたヌクレオチドがDNAポリメラーゼの伸長反応をさまたげ、短いPCR産物しか得られない場合もあります。

そのため、Taq DNA PolymeraseやFastStart Taq DNA Polymeraseよりも正確性の優れた増幅反応が求められるアプリケーション(PCR産物のクローニングやシークエンスなど)には、エディティング活性またはプルーフリーディング活性をもつ耐熱性DNAポリメラーゼを使用する必要があります。プルーフリーディングDNAポリメラーゼはポリメラーゼ活性とは別に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するため、誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除くことができます。

例えば、Pwo SuperYield DNA Polymeraseは、Taq DNA Polymeraseに比べてはるかにエラー率が低く(約18倍まで)、3kbまでのターゲットを高い正確性で増幅するための理想的な酵素です。

プルーフリーディングDNAポリメラーゼの注意点

既知のプルーフリーディングDNAポリメラーゼはいずれも、ウラシル-DNA N-グリコシラーゼ(UNG)を使用するキャリーオーバー防止法を適用できないという欠点があります。

プルーフリーディングDNAポリメラーゼは、archaeal(古細菌)起源のB型DNAポリメラーゼファミリーに属します。B型DNAポリメラーゼはプルーフリーディング(3'-5'エキソヌクレアーゼ)活性を有しますが、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性はありません。

Taq DNA Polymeraseとは対照的にarchaeal DNAポリメラーゼはウラシル基を含むDNA鎖を複製することができません。この酵素はいわゆる「先読み」機能によりテンプレートDNA鎖中のdU基を検出し、DNA合成をそこで停止させます(Martin A. Greagg et al., 1999)。したがって、dTTPをdUTPに置換するとB型DNAポリメラーゼによるPCRが阻害されてしまいます。

PCR酵素ミックスチャーと酵素ブレンド

PCRの高度化に伴い、酵素ミックスチャーや酵素ブレンドが使われるようになりました。これらDNAポリメラーゼの酵素ブレンドは特別な目的のために使用され、個々の酵素をはるかに上回る性能を発揮します。

以下にその例をいくつか見ていきましょう。

一つ目に、Taq DNA Polymeraseを別の耐熱性プルーフリーディングポリメラーゼまたはプルーフリーディング活性をもつ他のタンパク質と組み合わせて使用することで、Taq DNA Polymeraseを単独で使用する場合に懸念される正確性の問題を克服することができます。このようなブレンド酵素(Expand High Fidelity PCR Systemなど)はTaq DNA Polymerase単独の場合に比べ、約3倍の正確さでDNAを読み取り、長い(5kbまで)ターゲットを増幅することが可能です。

次に、GC-RICH PCR Systemは、GCリッチの配列から高い収量のPCR産物を得るために最適な酵素ブレンドです。

また、FastStart High Fidelity PCR Systemは、1反応中から複数のターゲットを増幅する(マルチプレックス PCR)のに適した利点を備えています。この酵素ブレンドは、Taq DNA Polymerase単独に比べてより正確(約4倍)にDNAを読み取り、GC含有率の高い(40~60%)配列の増幅に適しています。

さらに、個々の酵素ブレンド、バッファー、および添加試薬を組み合わせることにより、非常に長いターゲットを正確に増幅することができます。例えば、Expand Long Range, dNTPackを用いて、25kbまでの長さのターゲットを増幅可能です。

また、ロシュ社は高正確性(high-fidelity)PCRとウラシルDNAグリコシラーゼを使用したキャリーオーバーコンタミネーション防止法の組み合わせを可能にするため、Expand High FidelityPLUS PCR SystemFastStart High Fidelity PCR Systemを発売しました。これらの酵素ブレンドは、単離同定された新しいプルーフリーディングタンパク質とTaq DNA Polymeraseにより構成されます。このタンパク質はプルーフリーディング活性を備えていますが、それ自身にポリメラーゼ活性はありません。したがってdUを含むDNAによりPCRが阻害されることはありません。

下の表は、ここまでに紹介したPCR酵素の性能を比較したものです。酵素選択の参考にしてください。

リバーストランスクリプターゼ

次にRT-PCR用の酵素について紹介します。RT-PCRはPCRの力をRNA増幅に拡張する技術で、通称リバーストランスクリプターゼ(Reverse Transcriptase)というRNA依存性DNAポリメラーゼを用いてRNAをcDNAに逆転写し、さらに耐熱性DNAポリメラーゼによりこのcDNAを検出可能なレベルにまで増幅させます。この反応のコンビネーションは、ワンステップ(1つのチューブ中で継続して反応させる)あるいはツーステップ(反応ごとに別のチューブを用い、継続して反応させる)で行われます。ワンステップおよびツーステップRT-PCR用として、さまざまなリバーストランスクリプターゼが発売されています。

例えば、Transcriptor Reverse TranscriptaseはツーステップRT-PCRに用いられ、最大14kbの長さのターゲットRNAを増幅することができます。

RT-PCRの用途(アンプリコンの長さ、GC含量、エラー率など)に応じて、ワンステップRT-PCRシステムを選択することもできます。Titan One Tube RT-PCR Systemは、6kbまでの長さで、GC含有率が通常の範囲のアンプリコンのRT-PCRに最適です。C. therm. Polymeraseは、3kbまでの長さのワンステップRT-PCRに有効です。

また、Tth DNA Polymeraseは、Mn2+イオン存在下でRNAテンプレートを逆転写し、短い(1kbまで)RNAテンプレートのワンステップ、ワンチューブRT-PCRに使用できます。

下の表はRT-PCR酵素の性能を比較したものです。

以上、主なPCR用酵素とRT-PCR用酵素について、その特徴と選び方を解説しました。まずは実験の条件や目的をよく吟味し、それらにあった酵素を選択しましょう。

参考文献
Greagg, M. A., Fogg, M. J., Panayotou, G., Evans, S. J., Connolly, B. A., and Pearl, L. H.(1999) A read-ahead function
in archaeal DNA polymerases detects promutagenic template-strand uracil. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,
9045-9050.