shRNAならより長期的に遺伝子をノックダウンできる

RNAiによる遺伝子ノックダウンは遺伝子の機能を解析する強力なツールのひとつです。RNAiによるノックダウンを行う方法として、特定の遺伝子をターゲットにして作成した短鎖干渉RNA（siRNA）や短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を細胞内に導入する方法があります。 shRNA はベクターによって細胞に導入され、トランスフェクションが困難な細胞や非分裂細胞での RNAi 実験にも効果的な、恒常的に遺伝子をノックダウンできるシステムです。shRNAは導入された細胞内で解離してsiRNAとなり、ターゲット特異的な遺伝子の発現を抑制します。siRNAを導入する方法では一過性の効果しか期待できませんが、shRNA発現プラスミドベクターを用いれば、siRNAを導入するよりも長期的なRNAi効果を発揮することができ、ターゲット特異的な遺伝子の発現を抑制します。

無料PDF(MISSION^®RNAi 総合カタログ)はこちら

shRNAライブラリーについてのご相談・サポート依頼​

shRNAレンチウイルスパーティクルによるノックダウンプロトコール

shRNAベクターはプラスミドDNAの形状でも細胞にトランスフェクションすることができますが、ウイルス粒子（ウイルスパーティクル）に封入することで細胞への導入効率が向上しsiRNAの安定発現を行うことができます。 MISSION^® shRNAは各ターゲット特異的にデザインされた配列を持ち、レンチウイルスパーティクルに封入されたshRNAも利用することができます。 ここでは、shRNAレンチウイルスパーティクルによるノックダウンプロトコールを紹介します。

＜1日目＞

1. トランスフェクションの24時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養する。
2. トランスフェクションは50～80％コンフルエントで行う。

＜2日目＞

1. ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり解凍する。

2. トランスフェクション効率を高めるためにHexadimethrine bromideを細胞に添加（最終濃度8 μg/mL）して振盪する。ただし、神経細胞の初代培養などにはHexadimethrine bromideは不適。

3. 適した量のウイルスパーティクルを添加して振盪する。初めての場合は、幾つかのmultiplicity of infection（MOI）を試すこと。※MOI：細胞に対するウイルス粒子の個数

4. 37℃で一晩インキュベートする。ただし、一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は、4時間インキュベーションを行った後に培地交換する。

＜3日目＞

ウイルスパーティクルを含む培地を除去し、新しい培地に交換する。

＜4日目＞

Ａ. トランジェント（一過性発現）で実験する場合 細胞を回収してqRT-PCRなどでノックダウン効率を検証する。 Ｂ. ステーブル（安定発現）で実験する場合 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換する。細胞により至適濃度は異なりますが、1～10 μg/mLが標準的。

＜5日目以降（ステーブルの場合のみ）＞

1. 3～4日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換する。（一般的に10 ～ 12日後くらいでクローンが確立）。

2. 5クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する。

以上、shRNAレンチウイルスによるノックダウンプロトコールを紹介しました。このように数日間にわたって実験を行う場合は、失敗して貴重な時間とサンプルを無駄にしないためにも、事前に手順を頭に入れ、しっかりと準備を整えてから行いましょう。

【オンライン技術相談】shRNAライブラリー

shRNAライブラリーについて、技術相談を実施しています。概算費用や製品紹介、その他具体的な相談など、お気軽にご相談ください。​​

<無料PDFダウンロード>
MISSION^® RNAi 総合カタログ

このカタログではRNAiの原理やプロトコル、使用する製品についてご紹介しています。

▼こんな方にオススメ
・RNAiの基礎を学びたい方
・これからRNAi実験に取り掛かる予定の方
・MISSION^® RNAi製品ならではの特長を知りたい方

無料PDF(MISSION^®RNAi 総合カタログ)をダウンロードする